HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ
YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VÀ HOẠT TÍNH
CỦA ENZYME INVERTASE NGOẠI BÀO CỦA CÁC
CHỦNG SACCHAROMYCES SPP.

HÀ NỘI – 2016


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG
SẢN XUẤT VÀ HOẠT TÍNH CỦA ENZYME INVERTASE NGOẠI BÀO CỦA CÁC
CHỦNG SACCHAROMYCES SPP.

Người thực hiện: PHẠM THÙY TRANG
Ngành

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Giang

HÀ NỘI – 2016


tới Bố, Mẹ, Ông, Bà và những người thân của tôi đã nuôi nấng, động viên và tạo động
lực cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn !
Sinh viên
Phạm Thùy Trang

4


MỤC LỤC

5


DANH MỤC HÌNH – ĐỒ THỊ

6


TÓM TẮT
Với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh và hoạt tính
của enzyme invertase ngoại bào từ các chủng nấm men Saccharomyces spp., tôi đã tiến hành
tuyển chọn các chủng nấm men Sacharomyces spp. có khả năng sinh enzyme invertase cao và
đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố từ các chủng nấm men được cung cấp. Dựa vào điều kiện
cho phép của phòng thí nghiệm, tôi tiến hành lựa chọn các chủng có khả năng cao thuộc chi
Saccharomyces, thấy rằng trong 20 chủng được cung cấp có 6 chủng thuộc chi
Saccharomyces. Bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Praveen Reddy và cộng sự,

2010), tôi đã tuyển chọn được 2 chủng 259 và 263 có khả năng sinh invertase ngoại bào cao.
Tôi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy như thời gian ủ,

sự, 2006; Oztop và cộng sự, 2009; Celebi và cộng sự, 2009), nhưng nó chỉ là một phụ
phẩm của ngành công nghiệp sản xuất bia và enzyme được sản xuất qua quá trình này
thường không ổn định và tinh sạch (Chan và cộng sự, 1991).
Vì vậy thu nhận invertase ngoại bào từ quá trình lên men chìm các chủng nấm
men Saccharomyces spp. như là một giải pháp cho các vấn đề trên.
Xuất phát từ những lý do trên, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng
của một số yếu tố đến khả năng sản xuất và hoạt tính của enzyme invertase ngoại
bào của các chủng Saccharomyces spp.” làm xác định một số thông số thích hợp với
quá trình lên men chìm các chủng nấm men Saccharomyces spp. và phát triển quy
trình sản xuất invertase từ Saccharomyces spp.
1.2.

Mục tiêu đề tài.
Tuyển chọn các chủng nấm men Saccharomyces spp. có khả năng sinh enzyme

invertase ngoại bào cao và nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sản
xuất ( thời gian ủ, nguồn carbon, nguồn nitrogen, pH môi trường nuôi cấy) và hoạt tính
của enzyme invertase ngoại bào của chúng ( pH đệm, ion kim loại, nồng độ cơ chất).
8


Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài.
 Đối tượng nghiên cứu.

1.3.

Các chủng nấm men được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh –
Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
 Nội dung nghiên cứu.
1. Tuyển chọn 1 – 2 chủng nấm men Saccharomyces spp. có khả năng sinh


2.1.2. Động học của invertase.
Nghiên cứu về động học enzyme là nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố như ảnh
hưởng của nồng độ cơ chất, enzyme, pH môi trường, nhiệt độ, các chất kìm hãm …
đến tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác. Việc nghiên cứu động học enzyme sẽ cho ta
biết được các vấn đề sau đây:
- Có thể biết được cơ chế phân tử của sự tác động của enzyme.
- Cho phép ta hiểu biết được mối quan hệ về mặt lượng của quá trình enzyme.
10


- Là điều kiện cần thiết để thực hiện các bước tinh chế enzyme.
- Khi lựa chọn các đơn vị hoạt động của enzyme cần phải biết những điều kiện tốt nhất
cho hoạt động của enzyme, cũng như cần phải biết được các yếu tố ảnh hưởng đến
hoạt động của chúng.
Các enzyme thường bị ức chế bởi sự có mặt của một số yếu tố như kim loại
nặng... Ví dụ như Pb2+ dễ dàng liên kết với nhóm –SH trong một phân tử protein.
protein-SH + Pb ++ + HS-protein -----> protein S-Pb-S-protein + 2H +
Các mối liên kết disulfide rất quan trọng trong việc tạo cấu trúc 3 chiều của một
protein, nó sẽ xác định enzyme đó có hoạt động hay không. Việc phá hủy các cầu nối
disulfide sẽ gây bất lợi cho enzyme. Ví dụ: ion Ag + gắn vào chuỗi bên histidine của
phân tử enzyme invertase và làm cho nó bị bất hoạt.
Có rất nhiều các nghiên cứu liên quan đến động học của enzyme invertase trong
đó:
Mona M. Rashad và Mohamed U. Nooman (2009) khi nghiên cứu về invertase ngoại
bào thu nhận từ Sacchromyces cerevisiae NRRL Y -12632 bằng phương pháp lên
men trên cơ chất là chất thải của carrot đỏ cho thấy pH tối ưu của nó là 6. Hoạt tính
của enzyme thể hiện cao nhất ở 50oC và giảm dần hoạt tính khi nhiệt độ cao hơn 50oC .
Sự ổn định của enzyme được duy trì ở 40 oC trong 1 giờ và chỉ còn 85% hoạt tính được
giữ lại ở 50oC. Ảnh hưởng của một số ion kim loại cũng được tác giả báo cáo cụ thể ở

nhiệt độ ổn định của enzyme là từ 20 - 55 oC và tối ưu là ở 50oC. Các ion kim loại hóa
trị 2 như Cu2+, Fe2+, Co2+ ở nồng độ 10mM ảnh hưởng nhất định đến hoạt tính enzyme,
cụ thể là nó đã làm tăng hoạt tính so với enzyme không được bổ sung .
2.1.3. Vai trò và ứng dụng của invertase.
Invertase phân bố rộng rãi trong sinh quyển đặc biệt là trong thực vật và vi sinh
vật.
Đối với thực vật, invertase là rất cần cho quá trình chuyển hóa, điều hòa áp suất
thẩm thấu và bảo vệ tế bào ( Samarth. và cộng sự,2013) .
Đối với nấm men, invertase giúp các tế bào nấm men chống chịu với ethanol
(Osho, 2005), có vai trò quan trọng trong quá trình lên men.
Nhờ các đặc tính của mình invertase còn được tách chiết và tinh chế để sản xuất
đường nghịch đảo ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp đặc biệt là ngành công
nghiệp sản xuất bánh kẹo, đồ uống…
Dung dịch đường nghịch đảo và HFS ( high fructose syrup) có thể sản xuất
công nghiệp bằng cách thủy phân sucrose bằng axit thủy phân. Tuy nhiên, phương
pháp này có hiệu suất thấp, thiếu vị ngọt, chứa nhiều sản phầm không mong muốn và
12


không kinh tế. Trong khi đó, sản xuất bằng enzyme invertase cho sản phẩm có độ tinh
khiết cao, ổn định, không bị kết tinh và không chứa các sản phẩm không mong muốn
(Rossi-Alva và Rocha-Leao, 2003; Tomotani và Vitolo, 2004; Kaur và Sharma, 2005;
Aranda và cộng sự, 2006; Oztop và cộng sự, 2009; Celebi và cộng sự, 2009) nên được
ưu tiên hơn.
Một số đặc tính của hỗn hợp đường khử được tạo thành từ sự thủy phân của invertase:
 Độ ngọt

Hỗn hợp gồm 50% đường đôi và 50% đường khử có độ ngọt cao hơn 20% so với
đường sucrose tinh khiết, rất thích hợp trong sản xuất nước trái cây và sẽ giảm được
20% lượng đường sử dụng.

lượng vỏ bánh, gây kích thích vị giác, tạo màu và củng cố kết cấu của bánh.
 Sản xuất kẹo cứng, kẹo mềm bọc chocolate: nhân kẹo được làm bằng đường
sucrose có trộn một lượng nhỏ invertase. Lúc đầu nhân khá cứng nên rất dễ để
bọc lớp chocolate bên ngoài. Sau một thời gian, enzyme hoạt động, sucrose đã
chuyển đổi thành hỗn hợp đường khử nên nhân kẹo trở nên mềm hơn, dẻo hơn
và có độ ngọt cao hơn.
 Chế biến nước trái cây: Đồ uống giàu năng lượng, cung cấp năng lượng tức thì.
Hỗn hợp đường khử giúp tăng thời gian bảo quản trong chế biến trái cây, tăng
mùi vị và kích thích vị giác.
 Mật ong: sử dụng cho ong ăn, trộn vào mật ong, hạn chế hoạt động của vi
khuẩn. tốt và thay thế thành phần hóa học thuần túy của mật ong làm mật ong
nhân tạo.
 Trong y dược: là thành phần trong thuốc ho dạng siro, Ngoài ra fructose trong
hỗn hợp đường khử còn được sử dụng cho bệnh nhân bệnh tiểu đường, vì sự
chuyển hóa fructose độc lập với sự tiết isulin.
Ngoài ra, nó còn được sử dụng trong sản xuất axit lactic, ethanol (Acosta và cộng sự,
2000; Sanchez và cộng sự, 2001).
2.2. Các vi sinh vật sử dụng để sản xuất enzyme invertase.
Invertase được tìm thấy ở trong cả động vật, thực vật bậc cao và vi sinh vật
nhưng vi sinh vật là lựa chọn tốt nhất do vi sinh vật sinh trưởng nhanh và dễ thao tác
(Matrai và cộng sự, 2000; Luxhoi và cộng sự, 2002; Gangadhara và cộng sự, 2008).
Hầu hết các loại vi sinh vật đều có khả năng sản xuất enzyme này như vi khuẩn
Arthrobacter globiformis (Win và cộng sự, 2004), Lactobacillus reuteri (de Gines và
cộng sự, 2000), Azotobacter chroococum (de la Vega và cộng sự, 1991), nấm kể cả
nấm men có Fusarium oxysporium (Nishizawa và cộng sự, 1980), Aureobasidium
pullulans (Yoshikawa và cộng sự, 2006), Fusarium solani (Bhatti và cộng sự, 2006),
Aspergillus niger (Zhang và Ge, 2006), Aspergillus ochraceus (Ghosh và cộng sự,
2001), Aspergillus oryzae (Kurakake và cộng sự, 2010), Thermomyces lanuginosus
(Chaudhuri và cộng sự, 1999), Pichia anomala (Perez và cộng sự, 2001), Rhodotorula
glutinis (Rubio và cộng sự, 2002), Rhodotorula dairenensis (Gutierrez-Alonso và cộng

Carbon không chỉ là yếu tố cơ bản của tế bào nó còn giúp duy trì quá trình trao
đổi chất của vi sinh vật sống (Costaglioli và cộng sự, 1997). Sự hiện diện của nguồn
carbon thích hợp trong môi trường đóng vai trò dinh dưỡng kích thích tăng trưởng và
có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sản xuất của nhiều enzyme (Rodriguez và cộng sự,
1997; Herwig và cộng sự, 2001).
15


Đối với nấm men Saccharomyces cerevisiae, các nguồn carbon khác nhau bao
gồm glucose, fructose, maltose, glycerol, ethanol, xylose, sucrose được sử dụng cho sự
tăng trưởng và sản xuất enzyme (Dworschack và Wickerham, 1961; Zhang và Ge,
2006; Martinezforce và Benitez, 1995).
Invertase ngoại bào được tiết ra bởi S.cerevisiae khi môi trường có chứa cơ chất
là sucrose hay raffinose (Carlson, 1999; Mwesigye và Barford, 1996; Dynesen và cộng
sự, 1998).
Trong quá trình lên men sucrose, invertase ngoại bào thủy phân sucrose thành
glucose và fructose, tế bào thu nhận và chuyển hóa chúng(Batista và cộng sự, 2004).
Việc sử dụng sucrose sẽ bị ức chế khi nồng độ glucose hoặc fructose vượt quá 5g/l và
chúng có khả năng ngang nhau trong việc ức chế chất dị hóa (Dynesen và cộng sự,
1998). Robledo-Olivo và cộng sự (2009) đề xuất rằng bổ sung thêm glucose ở nồng độ
thấp sẽ tăng sự tiết enzyme invertase ở nấm.
Ngoài nguồn carbon thì nguồn nitrogen là thành phần cơ bản của môi trường
nuôi cấy.Nó đóng một vai trò quan trọng trong việc tổng hợp enzyme vì cung cấp các
amino acid. Trong tự nhiên, nấm men gặp nhiều nguồn nitrogen trong môi trường
sống. Tuy nhiên, không phải nguồn nitrogen nào cũng hỗ trợ tốt như nhau cho sự tăng
trưởng. Việc sử dụng nguồn nitrogen thích hợp thúc đẩy sự tăng trưởng tốt hơn các
nguồn nitrogen không thích hợp (Magasanik, 1992).
Nhiều nghiên cứu sử dụng kết hợp nhiều hơn một nguồn nitrogen giúp tăng
cường sự sản xuất invertase trong nấm men. Sự kết hợp của các nguồn nitrogen hữu cơ
như pepton và cao nấm men (yeast extracts) với nguồn carbon thích hợp cho năng suất

carbon cho sự tổng hợp enzyme invertase là lớn nhất (0.36 ± 0.005 IU/ml). Trong khi
đó, không có sự sản xuất invertase được ghi nhận khi bổ sung xylose và trehalose.
Đối với nguồn nitrogen, tác giả nghiên cứu ảnh hưởng của cả nguồn nitrogen vô
cơ và nitrogen hữu cơ với nồng độ 0,5%. Nguồn nitrogen vô cơ được khảo sát gồm
ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium molybdate, potassium nitrate và
sodium nitrate. Ammonium chloride là nguồn nitrogen vô cơ tốt nhất cho sự tổng hợp
enzyme (0.28 ± 0.11 IU/ml). Trong khi đó nguồn nitrogen hữu cơ tốt nhất cho sự tổng
hợp enzyme là yeast extract (0.25 ± 0.005 IU/ml).
Saccharomyces cerevisiae MK có khả năng sinh invertase trong một khoảng pH
khá rộng từ 4 đến 8 trong đó tối ưu tại pH = 6 và nhiệt độ tối ưu cũng đã được ghi
nhận là 30oC.
Ngoài các yếu tố môi trường trên, tác giả cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của rất nhiều
yếu tố khác như thời gian ủ, mật độ tiếp giống, nồng độ sucrose...
17


Ngoài Saccharomyces cervisiae thì các loài khác trong chi Saccharomyces
cũng được nghiên cứu như Saccharomyces carlsbergensis. Trong báo cáo của
Muhammad Umar Hayyat và Sikander Ali (2013) các chủng Saccharomyces
carlsbergensis sau khi được gây đột biến bằng tia UV thì chủng UV-dg4 đã cải thiện
được khả năng sản xuất invertase ngoại bào lên khoảng 17,86 lần so với chủng hoang
dại. Và các điều kiện của môi trường nuôi cấy chủng UV-dg4 đã được nghiên cứu tiếp
để hiệu quả sản xuất invertase ngoại bào được cao nhất.
Cụ thể trong nghiên cứu này thì nguồn carbon tốt nhất được sử dụng để chủng
UV-dg4 sinh enzyme là sucrose và nồng độ 10g/l được ghi nhận là cho sự tổng hợp
invertase ngoại bào cao nhất (14.69 U/ml/min). Trong các nguồn nitrogen được nghiên
cứu gồm urea, pepton, soybean, (NH4)2SO4, NH4NO3 và NH4Cl thì soybean cho hiệu
quả sản xuất invertase cao 29,657 (U/ml/min) , có thể thấy rằng đây là 1 nguồn rất
giàu dinh dưỡng với 42% proteins, 29.9% carbohydrates , 4% fats, 0.25% calcium,
0.25% magnesium , 0.63% phosphorous, 1.75% potassium, 0.32% sulphur và nồng độ

bào tử. Thế hệ sinh dưỡng của các giống này trong điều kiện bình thường là các thể
lưỡng bội. Khi già chúng thường kết thành vòng và mọc trên dịch lên men sợi giả, có
thể kết thành màng nổi. Lên men đường tốt nhưng nồng độ đường không quá 30%
(chính vì điều này những nấm men này được gọi là giống “nấm đường”) và tạo thành
tới 18% cồn etylic.
Trong 18 loài có 7 loài có nhiều ý nghĩa và đóng góp trong sản xuất lên men.
1. Saccharomyces vini Meyen ( Theo Lodder – S. cerevisiae Hansen)

Đây là loài nấm men rất phát triển ở các loại quả ngọt, ở dịch rau quả. Chúng lên
men dịch quả, đặc biệt là dịch quả nho tạo thành những rượu nho và thường gọi là
rượu vang. Tên của loài này trước đây được gọi là Saccharomyces ellipsoideus, bắt
nguồn từ hình dáng tế bào của chúng là hình ellip.
Trong dịch quả lên men ta thấy giống Saccharomyces chiếm tới 80% số tế bào vi
sinh vật có mặt. Dịch lên men được phủ một lớp bọt trên bề mặt. Men này có hai dạng:
dạng bụi dễ làm đục và dạng bông dễ kết tủa, dễ lắng làm trong dịch lên men.
19


Nói chung các nòi thuộc loại này cần các nguồn dinh dưỡng là đường, rượu và axit
hữu cơ. Các nguồn chất sinh trưởng của chúng là axit pantothenic (Vitamin B 3), biotin
(Vitamin H và B7), mezoinzoit, tiamin (Vitamin B1) và pyridoxin (Vitamin B6).
2. Saccharomyces cerevisiae Meyen ( Theo Lodder- S.cerevisiae Hansen)

Loài nấm men này được dùng trong công nghiệp cồn etylic, men bánh mì và bia.
Hình dáng các chủng của nó không khác nhau nhiều lắm so với các chủng cùng giống.
Khả năng tạo thành bào tử túi của S.cerevisiae kém hơn S.vini, S.uvarum. Loài này có
đặc điểm lên men đường từ tinh bột sâu xa hơn so với các loài khác, vì rằng nó có thể
lên men được những dextrin đơn giản.
3. Saccharomyces uvarum Beijerinck ( Theo Lodder- S. uvarum Beijerinck)


bayanus Saccardo)
Các chủng thuộc loài men này được phân lập từ dịch quả nho lên men tự nhiên
thường dùng trong sản xuất rượu sâm panh (champagne).
Những giống S. oviforrmis thuần chủng có tế bào tương tự như các loài khác, phát
triển tốt ở dịch nho, lên men gần như toàn bộ đường trong dịch quả và có thể tích tụ tới
18o cồn (nếu dịch quả có hàm lượng cao hoặc quá trình lên men được bổ sung đường).
Nhu cầu về chất sinh trưởng của loài men này cũng giống như S.vini. Trong giai đoạn
đầu S.oviformis thường phát triển chậm so với S.vini, nhưng sức chịu đựng cồn lại cao
hơn và như vậy ở giai đoạn cuối lại phát triển tốt hơn. Do vậy, nó thường được dùng
kết hợp với S.vini trong lên men rượu vang có hàm lượng đường cao và để sản xuất
vang “khô” (lên men hết đường)
Các chủng S. oviformis khi kết thúc lên men thường tạo thành một màng trên bề mặt
dịch. Chúng thường được dùng trong sản xuất rượu vang từ dịch quả có hàm lượng
đường cao, đặc biệt trong sản xuất sâm panh để có sản phẩm lên men để có nồng độ
cồn cao tự nhiên.
 Sacharomyces oviformis cheresiensis

Loài này lên men đường mạnh, có thể tạo thành tới 16,5 o cồn trong dịch lên men.
Khi kết thúc lên men cũng tạo thành lớp màng trên mặt dịch. Trong quá trình bị rượu
bị oxy hóa và kết quả sẽ tạo thành chất axetaldehyt (tới 700mg/l) cùng với các este bay
hơi làm cho vang có hương thơm quả anh đào.
Điều kiện thích hợp cho men Cheres phát triển tốt là nhiệt độ 18- 20 oC và phải đủ
không khí. Có thể dùng men này để chữa các loại vang có tích tụ axit axetic và axit
lactic (vang có hai loại axit này thường có mùi chuột).
7. Saccharomyces chodati Steiner ( theo Lodder- S.italicus Casteli)

Men này được phân lập từ nước nho lên men tự nhiên ở Thụy Sĩ, không lên men
được sucrose, nhưng lên men tốt glucose và fructose.

21

(Đức)

- Kính hiển vi LEICA DM750 (Trung Quốc) - Nồi hấp HVE – 50 (Nhật Bản)
- Lò vi sóng EM – G4777S (Nhật Bản)

- Tủ ấm JSBI – 150C (Hàn Quốc)

- Máy cất nước WSC/4D (Anh)

- Tủ cấy vô trùng (Hàn Quốc)

- Máy đo pH bàn Meter S20 (Thụy Sỹ)

- Tủ lạnh GN – 185SS (Việt Nam)

- Máy khuấy từ gia nhiệt ARE (Italy)

- Tủ sấy dụng cụ JSOF – 100 (Hàn
Quốc)

3.1.3. Thành phần môi trường thí nghiệm.

Môi trường hoạt hóa và cấy chuyền và thử khả năng sinh enzyme ngoại bào của
Saccharomyces spp.
Thành phần môi trường (g/l): yeast extract 3, pepton 5,sucrose 20 , agar 20, pH 6.
3.2.
Phương pháp nghiên cứu.
3.2.1. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, hóa sinh của các chủng nấm men sử

dụng trong nghiên cứu.

3g

Glucose

10g

Pepton

5g

Nước

1000ml.

Cách tiến hành:
Cấy tế bào nấm men nuôi sau một ngày tuổi vào bình 250ml chứa 50ml môi trường
dịch thể.
Nuôi cấy ở 300C sau hai đến ba ngày tiến hành lấy mẫu quan sát quá trình nảy chồi.
3.2.1.3.

Quan sát khả năng tạo bào tử (Nguyễn Lân Dũng, 2009).

Mục đích: Xác định một chủng có khả năng hình thành bảo tử hay không.
Môi trường: Môi trường Gorodkowa
Nước thịt:

1g

Pepton:


Nguyên tắc: Vi sinh vật có khả năng lên men đường tạo ra các sản phẩm: rượu,
các acid hữu cơ, CO2. CO2 được tạo thành sẽ được bẫy lại tạo thành bọt khí trong các
ống chuông Durham.
Môi trường :
M1: 0.5% cao nấm men.
M2: 0.5% cao nấm men + 1% sucrose
M3: 0.5% cao nấm men + 1% glucose.
Cách tiến hành:
- Mỗi chủng sẽ được nuôi trong 3 môi trường M1, M2, M3.
- Đặt ngược một ống Durham vào trong một ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy.
Sau đó hấp khử trùng môi trường.
- Cấy 100μl dung dịch huyền phù nấm men có mật độ 10 7 tế bào/ml vào các ống
nghiệm chứa môi trường đã được khử trùng. Nuôi các ống nghiệm này ở 30 0C, quan
sát trong 1 tuần.

24


- Nếu có khả năng đồng hóa sucrose và glucose thì ở đáy ống Durham sẽ quan sát thấy
việc tạo CO2 ( Xuất hiện bọt khí trong ống Durham). Nếu khả năng đồng hóa mạnh
sinh nhiều CO2 sẽ đẩy các ống Durham nổi lên.
3.2.1.5.

Khả năng đồng hóa urea (Nguyễn Lân Dũng, 2009).

Mục đích: Xác định xem một chủng nấm men có khả năng sinh enzyme urease.
Nguyên tắc: Nếu nấm men có khả năng sinh urease sẽ phân giải urea làm giảm pH
môi trường. Chất chỉ thị phenol red sẽ chuyển từ màu vàng sang màu hồng.
Môi trường: môi trường Christensen.
Pepton:

Hồng

Cách tiến hành: Bổ sung 6ml dung dịch đỏ phenol (phenol red) có nồng độ 0,2%
trong cồn vào môi trường. Khử trùng môi trường. Đợi nguội đến 50 0C rồi bổ sung urea
(20g urea/ 1100ml môi trường). Sau đó cấy nấm men và giữ ở 26 0C trong 7 ngày.
Quan sát màu môi trường nuôi cấy.
3.2.2. Phương pháp lên men và xác định hoạt tính enzyme.
3.2.2.1.
Phương pháp lên men chìm.
25