1
B1-2-TMĐT

THUYẾT MINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
KHOA HỌC VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ
1I. THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI
1 Tên đề tài
XÂY DỰNG CÁC KIT CHẨN ĐOÁN TÁC
NHÂN GÂY BỆNH TAI XANH VÀ BỆNH TIÊU
CHẢY CẤP TRÊN HEO NUÔI BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ
2 Mã số (được cấp khi Hồ
sơ trúng tuyển)
3 Thời gian thực hiện: 24 tháng 4 Cấp quản lý
(Từ tháng 01 /2010 đến tháng 12 /2011
Nhà nước Bộ
Tỉnh Cơ sở
5 Kinh phí 1.175,168 triệu đồng, trong đó:
Nguồn Tổng số

- T
ừ Ngân sách sự nghiệp khoa học
1.135,168 triệu đồng

- Từ nguồn tự có của tổ chức

- Từ nguồn khác


Họ và tên: PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương
Ngày, tháng, năm sinh: 19/10/1959 Nam/ Nữ: Nữ
Học hàm, học vị: PGS
Chức danh khoa học: PGS
Chức vụ: Trưởng Phòng Đào tạo Sau Đại Học, Trưởng Bộ môn Di truyền
Điện thoại:
Tổ chức: 38350097 Nhà riêng: Mobile: 0918033123
Fax: 38304924 E-mail: [email protected]
Tên tổ chức đang công tác: Trường Đại học Khoa học và Tự nhiên tp HCM
Địa chỉ tổ chức: 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp HCM.
Địa chỉ nhà riêng:
9 Thư ký đề tài
Họ và tên: Trịnh Thị Thanh Huyền
Ngày, tháng, năm sinh: 27/03/1985 Nam/ Nữ: Nữ
Học hàm, học vị: Kỹ sư
Chức danh khoa học:

3

Chức vụ: Chuyên viên sở Khoa học công nghệ Đồng Nai.
Điện thoại:
Tổ chức: 0613.82297 Nhà riêng: 0613990118 Mobile: 0917737270.
Fax: 0613.825585 E-mail: [email protected]
Tên tổ chức đang công tác: Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học-Sở Khoa học công
nghệ Đồng Nai
Địa chỉ tổ chức: 260, Phạm Văn Thuận, phường thống nhất, Biên Hòa, Đồng Nai
Địa chỉ nhà riêng: 45D/Cư Xá Lắp Máy 45/4, Kp5, P.Trảng Dài, Biên Hòa, Đồng Nai
10

Tổ chức chủ trì đề tài


Các cán bộ thực hiện đề tài

(Ghi những người có đóng góp khoa học và chủ trì thực hi
ện những nội dung chính thuộc tổ
chức chủ trì và tổ chức phối hợp tham gia thực hiện đề tài, không quá 10 ngư
ời kể cả chủ nhiệm
đề tài)

Họ và tên, học
hàm học vị
Tổ chức
công tác
Nội dung công việc tham gia
Thời gian làm
việc cho đề tài

(Số tháng quy
đổi
2
)
1 Nguyễn Thị
Hoàng
Sở Khoa Học
& Công Nghệ
Đồng Nai
Chủ nhiệm đề tài – chịu trách
nhiệm về điều phối thực hiện đề
tài
24

kit PRRSV và real-time PRRSV,
TGEV/PEDV/rotavirus
24
5 Nguyễn Tân Lang Chi cục Thú y
Đồng Nai
Chịu trách nhiệm nội dung lấy
mẫu
18
6 Trịnh Thị Thanh
Huyền
Trung Tâm
Ứng Dụng
Công Nghệ
Sinh Học
Đồng Nai
Thành viên – chịu trách nhiệm
nội dung nghiên cứu về bệnh
tích trên bệnh tai xanh và tiêu
chảy cấp
24
7 Đào Thụy Mỹ
Châu
Công ty
TNHH CNSH
Khoa Thương

Thành viên – chịu trách nhiệm
thực hiện nội dung xây dựng kit
các vi khuẩn gây tiêu chảy cấp
12

Mới Kế tiếp hướng nghiên cứu của chính nhóm tác giả
Kế tiếp nghiên cứu của người khác
15 Tổng quan tình hình nghiên cứu, luận giải về mục tiêu và những nội dung nghiên
cứu của Đề tài
15.1 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của Đề tài
Ngoài nước (Phân tích đánh giá được những công trình nghiên cứu có liên quan và những
kết quả nghiên cứu mới nhất trong lĩnh vực nghiên cứu của đề tài; nêu được những bước
tiến về trình độ KH&CN của những kết quả nghiên cứu đó) Bệnh “tai xanh” hay còn gọi là hội chứng hô hấp và sinh sản ở heo (PRRS – Porcine
Reproductive and Respiratory Syndrome) được ghi nhận lần đầu tiên ở Mỹ vào khoảng năm
1987. Tác nhân gây bệnh được xác định năm 1991, là virus RNA thuộc bộ Nidovirales, họ
Arteriviridae, giống Arterivirus. Hai chủng chính được xác định gồm: (1) genotype 1 với
prototype Lelystad (thường được gọi là chủng Châu Âu) và genotype 2 với prototype
VR2332 (chủng Bắc Mỹ). Gần đây, một biến thể của genotype 2 có độc lực cao hơn đã gây
nhiều tổn thất ở châu Á. Bệnh làm giảm tỉ lệ sinh sản, gây sảy thai, heo chết lúc sinh ở heo
nái, và gây rối loạn hô hấp dẫn đến tử vong cho heo con. Bệnh có thể lây lan nhanh trong
đàn heo trong 7-10 ngày. Theo Tổ chức Lương Nông Thế giới (FAO), các yếu tố chủ chốt
kiểm soát và loại bỏ dịch PRRS bao gồm phát hiện bệnh sớm và có phương pháp phân tích
nhanh và chính xác, nhận diện nhanh các đàn heo nhiễm và sử dụng những biện pháp dập tắt

7

dịch hiệu quả.
Năm 2007, dịch PRRS xảy ra tại Trung Quốc làm chết gần 70.000 con heo và buộc
nước này phải tiêu hủy khoảng 200.000 heo nghi bệnh tạo nên cơn sốt giá trên thị trường thịt
lên đến 74.6%. Người ta cho rằng virus gây bệnh PRRS tại nước này là chủng Châu Mỹ độc
lực cao. Chủng virus này sau đó cũng đã lây lan sang nhiều nước trên thế giới gây khó khăn,
phức tạp trong quá trình chẩn đoán, phân biệt giữa chủng thường và chủng độc lực cao này.

Diarrhea Virus) và TGEV (Transmissible Gastroenteritis Virus) có khả năng lây nhiễm rất cao.
PEDV được phân lập vào năm 1978 ở châu Âu nhưng tỉ lệ lưu hành ở châu Âu hiện
nay đã giảm đáng kể. Trong khi đó ở châu Á từ những năm 1990, PEDV bắt đầu nổi lên như
một tác nhân dịch bệnh quan trọng, đặc biệt là ở Hàn Quốc và Nhật Bản, với tỉ lệ gây chết
lên đến 50 – 95 % ở heo con nhỏ hơn 2-3 tuần tuổi. PEDV là một virus RNA mạch đơn với
bộ gene chứa các gene mã hóa cho các protein pol1 (P1), spike (S), envelope (E), membrane
(M) và nucleocapsid (N); trong đó hai protein được quan tâm là protein S có chức năng gắn
với thụ thể tế bào chủ và protein M tham gia vào quá trình “tự ráp” của virus. Cơ chế gây
bệnh của PEDV bắt đầu với sự bám của protein S virus lên thụ thể aminopeptidase N trên bề
mặt lông nhung ruột dẫn đến sự phá hủy biểu mô lông nhung. Điều này sẽ làm biến đổi quá
trình tiêu hóa sữa, vận chuyển tế bào và hấp thụ chất dinh dưỡng ở heo con. Các phương
pháp chẩn đoán dựa trên nuôi cấy phân lập virus, miễn dịch học, phổ biến là ELISA, sử dụng
kính hiển vi điện tử, và một số phương pháp sinh học phân tử phổ biến là RT-PCR. Các
phương pháp ELISA và PCR tiến hành trực tiếp trên phân hoặc trên mẫu mô ruột non heo.
Trong phương pháp RT-PCR, primer sử dụng thường được thiết kế trong vùng gene S hay M.
Hiện nay đã có một số vaccine được phát triển dựa trên chủng PPEDV-9 (Hàn Quốc) hay P-
5V (Nhật Bản), được chỉ định dùng cho heo nái nhưng chưa phổ biến.
TGEV được phát hiện đầu tiên năm 1946 ở Hoa Kỳ, và được ghi nhận sau đó ở tất cả
các nước có ngành chăn nuôi heo phát triển, gây tổn thất kinh tế lớn. Chỉ riêng ở Iowa (Hoa
Kỳ) trong khoảng 1987-1988, tổn thất do TGEV gây ra cho đàn heo là 10 triệu USD. TGEV
là một virus RNA mạch đơn có bộ gene với 8 mRNA: mRNA 2 (S), 3, 3-1, 4 (sM), 5 (M), 6
(N) và 7 mã hóa cho các protein S, sM, M, N và một protein màng. Tác hại TGEV gây ra
trên đàn heo thay đổi tùy thuộc tình trạng miễn dịch của heo: (1) có thể gây chết 100 % heo
con ở đàn chưa từng tiếp xúc với virus, (2) gây chết khoảng 20 % ở những đàn đã được miễn
dịch một phần hoặc (3) gây những đợt dịch ngắt quãng ở những đàn trong đó heo nái đã
được miễn dịch. Cơ chế gây bệnh tương tự như PEDV. Các phương pháp chẩn đoán giống

9

với trường hợp PEDV. Trong phương pháp RT-PCR phát hiện TGEV, primer sử dụng

hiện các gen adhesin, các gene mã hóa độc tố đường ruột như LT, Sta, STb đối với chủng
ETEC, gene Stxe đối với chủng STEC và eaeA đối với chủng AEEC.
Clostridium là nhóm vi khuẩn được xem là tác nhân gây bệnh đường ruột phổ biến ở
người và động vật. Trong đó C. perfringens là tác nhân gây bệnh đường ruột chính ở vật
nuôi. Đây là một vi khuẩn Gram (+), kỵ khí, được phân thành nhiều type. C. perfringens type
C từ lâu đã được biết là tác nhân phổ biến gây viêm ruột hoại tử xuất huyết ở heo con nhỏ
hơn 10 ngày tuổi. Sau đó type A cũng được xem là có khả năng gây bệnh ở heo và nhiều
động vật khác. Vi khuẩn này có thể tạo ra từ 1 đến 20 loại ngoại độc tố, trong đó có 5 loại
chính , , ,  và CPE. Độc tố

đóng vai trò chủ chốt trong tính gây bệnh của C.
perfringens type A. Còn ở type C người ta phát hiện cả hai loại độc tố

và

. Chẩn đoán
hiện nay dựa trên việc phát hiện cả hai type với type A khó phát hiện hơn do không có biểu
hiện biến đổi hình thái tế bào rõ ràng. Các phương pháp chẩn đoán chính bao gồm: chẩn
đoán lâm sàng, soi kính hiển vi nhằm phát hiện các thương tổn mô và tế bào, nuôi cấy định
danh, phát hiện các độc tố dựa trên kỹ thuật miễn dịch như ELISA hay tụ latex, và các
phương pháp sinh học phân tử như lai phân tử và PCR. Các phương pháp sinh học phân tử
chủ yếu tập trung phát hiện sự hiện diện của các gene độc tố như

,

,

,

, và cpe. Phương

sự (2007) sử dụng các phương pháp ELISA, phân lập virus, RT-PCR, IPMA điều tra sự lưu
hành của virus trên 8 tỉnh thành (Tp HCM, Đồng Nai, Bình Dương, Tiền Giang, Long An,
Tây Ninh, Bà Rịa Vũng tàu và Khánh Hòa) cho thấy tỉ lệ nhiễm là 40,2 %, trong đó khu vực
chăn nuôi gia đình nhiễm 31,9 % - 48,8 % và toàn bộ các trại chăn nuôi công nghiệp đều bị
nhiễm. Tình trạng nhiễm xảy ra ở heo thuộc mọi lứa tuổi. Công trình của Youjun Feng và
cộng sự (2008) tiến hành trên một số chủng PRRSV phân lập ở Việt Nam và ở Trung Quốc
năm 2007 cho thấy 99 % đồng nhất ở trình tự bộ gene giữa các chủng này, đặc biệt chúng
đều thiếu một trình tự 30 amino acid ở protein “không cấu trúc” (nonstructural protein) 2.
Các tác giả dự đoán chủng Việt Nam có thể có cùng nguồn gốc với chủng Trung Quốc và bắt
nguồn từ đợt dịch lớn xảy ra năm 2006 trên hơn nửa lãnh thổ Trung Quốc, tác động đến trên
hơn 2 triệu heo nuôi. Một công trình khác của Lê Thanh Hòa và cộng sự (2009) tìm hiểu đặc
tính di truyền của chủng PRRSV phân lập từ heo bệnh ở Việt Nam dựa trên việc phân tích
gene M mã hoá protein màng của virus cũng cho kết quả tương tự.

12

Đối với các tác nhân gây tiêu chảy cấp PEDV và TGEV, đã có đề tài luận văn Thạc sĩ
của Vũ Thị Lan Hương (2007) nghiên cứu về tình hình phơi nhiễm ở heo với các tác nhân
này bằng phương pháp ELISA. Không thấy công trình công bố trên nhóm rotavirus gây tiêu
chảy cấp ở Việt Nam.
Đối với các vi khuẩn gây tiêu chảy cấp trên heo, công trình của Hideki Kobayashi và
cộng sự (2003) tiến hành trên mẫu heo và mẫu từ môi trường nuôi heo lấy tại Cần Thơ cho
thấy sự hiện diện của STEC và AEEC với tỉ lệ 29 % trên tổng số trại nghiên cứu, không thấy
sự hiện diện của chủng ETEC. Trong khi đó, một công trình khác (Thuy N. Do và cộng sự,
2006) thực hiện trên heo con trước cai sữa ở miền Bắc cho thấy 43 % trường hợp tiêu chảy ở
heo mới đẻ và 23,9 % là trên heo con cho đến khi cai sữa là do E. coli chủng ETEC gây ra.
Trong một công trình nghiên cứu so sánh các chủng Salmonella trên heo nuôi (Tran
Thi Phan và cộng sự, 2001), kết quả khảo sát trên 13 mẫu cho thấy sự phân bố các chủng là

S. Derby (n = 8), S. Javiana (n=4), S. Typhimurium O9 (n=1). Hiện tại, ở Việt Nam, tình

hiệu quả. Chăn nuôi heo chịu tác động của nhiều dịch bệnh, trong đó dịch “tai xanh” và tiêu
chảy cấp gây nhiều tổn thất kinh tế lớn.

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên
đàn heo nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương tính). Trên những trại heo giống tại
các tỉnh phía Nam, tỷ lệ heo có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau từ 1,3% cho
tới 68,29%.Tỉnh Đồng Nai không nằm ngoài diễn biến dịch bệnh của cả nước. Với nhiều cơ sở,
hộ nông dân hoạt động trong lĩnh vực chăn nuôi, trong đó đàn heo chiếm tỷ trọng khá
cao, ngành chăn nuôi trong nhiều năm qua gặp nhiều khó khăn do tình hình giá cả bất ổn,
và dịch bệnh hoành hành.
Theo báo cáo của Tổ chức Sức Khỏe Động vật, trong khoảng
tháng 3 đến tháng 8/2007, có 44 điểm dịch ở các tỉnh miền bắc (tháng 3-tháng 5) và ở
các tỉnh miền nam (tháng 6-tháng 7) gây chết 4.000 heo trên 44.000 con mắc bệnh.
Trong tháng 8, 9/2007, thêm 9 đợt dịch xảy ra ở Khánh Hòa, Cà Mau và Lạng Sơn với tỉ
lệ tử vong là 24 %. Từ các vùng có dịch, heo bệnh vẫn được vận chuyển đến các vùng
tiêu thụ khác nhau, từ đó bệnh nhanh chóng lan truyền sang các tỉnh phía nam. Tác nhân
gây bệnh này tồn tại trong dịch mũi, nước bọt, tinh dịch, phân, nước tiểu và có thể phát
tán theo gió rất nhanh và thông qua việc tiếp xúc, vận chuyển heo bệnh. Trong những
năm qua ngành chăn nuôi nước ta cũng như các nước khác trên thế giới vẫn sống chung

14

với loại bệnh này tuy nhiên gần đây tại Trung Quốc xuất hiện trận dịch lớn gây chết
hàng loạt trên heo nuôi, người ta xác định nguyên nhân là do tác nhân PRSSV – chủng
virus Bắc Mỹ độc lực cao gây ra. Từ Trung Quốc tác nhân này lây lan sang nhiều nước
trong đó có Việt Nam và cũng đã gây thiệt hại rất lớn trên diện rộng. Khó khăn thứ nhất
hiện nay là làm sao phân biệt được chủng độc lực cao và chủng thường để có biện pháp

Việc xây dựng các phương pháp chẩn đoán nhanh, chính xác các tác nhân gây bệnh để
kịp thời phát hiện ổ dịch, cách ly và tìm phương pháp xử lý là cần thiết. Phương pháp PCR
có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và thời gian tiến hành ngắn có thể là một công cụ bổ sung hiệu
quả cho các kit ELISA vẫn được sử dụng hiện nay (ELISA khó phân biệt kháng thể do tiêm
vaccine hay kháng thể do mầm bệnh).
Chúng tôi tiến hành xây dựng các kit phát hiện các tác nhân gây bệnh “tai xanh” và
tiêu chảy cấp trên heo có tính chính xác cao với mục đích góp phần vào công tác kiểm soát
các dịch trên ở địa bàn tỉnh Đồng Nai nói riêng và các địa phương khác có nhu cầu.
16
Liệt kê danh mục các công trình nghiên cứu, tài liệu có liên quan đến đề tài đã trích
dẫn khi đánh giá tổng quan
(Tên công trình, tác giả, nơi và năm công bố, chỉ nêu những danh mục đã được trích dẫn để
luận giải cho sự cần thiết nghiên cứu đề tài)
1. Do T.N., Cu P.H., Nguyen H.X., Au T.X., Vu Q.N., Driesen S.J., Towsend K.M., Chin J
J-C., & Trott D.J. 2006. Pathotypes and serogroups of enterotoxigenic Escherichia coli
isolated from pre-weaning pigs in north Vietnam. J. Med. Microbiol. 55:93-99.
2. FAO EMPRES. 2007. Focus on: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS)
regional awareness. Issue No 2.
3. Feng Y., Zhao T., Nguyen T., Inui K., Ma Y., Nguyen T.H., Nguyen V.C., Liu D., Bui
Q.A., To L.T., Wang C., Tian K., & Gao G.F. 2008. Porcine Respiratory and Reproductive
Syndrome Virus Variants, Vietnam and China, 2007. Emerging Infectious Diseases –
www.cdc.gov/eid - 14:1774-1776.
4. Huynh T.T.T., Aarnink A.J.AS., Drucker A., Verstegen M.W.A. Pig production in
Cambodia, Laos, Philippines, and Vietnam: a review. Asian J. Agri. Develop. 4:69-90.
5. Ishikawa K., Sekiguchi H., Ogino T., & Suzuki S. 1997. Direct and rapid detection of
porcine epidemic diarrhea virus by RT-PCR. J. Virol. Methods,
6. Jung K. & Chae C. 2004. RT-PCR-based dot blot hybridization for the detection and

16


(Liệt kê và mô tả chi tiết những nội dung nghiên cứu khoa học và triển khai thực nghiệm phù
hợp cần thực hiện để giải quyết vấn đề đặt ra kèm theo các nhu cầu về nhân lực, tài chính và
nguyên vật liệu trong đó chỉ rõ những nội dung mới, những nội dung kế thừa kết quả nghiên
cứu của các đề tài trước đó; những hoạt động để chuyển giao kết quả nghiên cứu đến người
sử dụng, dự kiến những nội dung có tính rủi ro và giải pháp khắc phục – nếu có
Đề tài bao gồm hai nội dung chính:
- Xây dựng các quy trình phát hiện các tác nhân gây bệnh “tai xanh” và tiêu chảy cấp ở heo
- Tạo 4 kit chẩn đoán và thử nghiệm trên mẫu thực địa
1. Xây dựng các quy trình phát hiện các tác nhân gây bệnh ”tai xanh“ và tiêu chảy cấp ở heo
Có 4 nhóm quy trình cần xây dựng là: quy trình xử lý mẫu và tách chiết RNA, DNA,
quy trình PCR và RT-PCR, quy trình real-time RT-PCR, quy trình tạo dòng nhằm xây dựng
các chứng dương cho các kit
1.1. Quy trình xử lý mẫu và tách chiết RNA virus hay DNA vi khuẩn
Tùy thuộc bản chất mẫu – huyết thanh, mô hay phân, cũng như loại nucleic acid cần
thu nhận – RNA hay DNA - mà quy trình cần được điều chỉnh cho phù hợp.
Chúng tôi khảo sát hiệu quả xử lý các loại mẫu bằng nghiền cơ học, nhiệt, proteinase,
hay các biện pháp phối hợp. Đặc biệt mẫu phân được xem như mẫu chứa nhiều chất ức chế
phản ứng PCR cần có bước tiền xử lý thích hợp.
Hai phương pháp tách chiết RNA, DNA được khảo sát là phương pháp phenol:
chloroform: isoamyl alcohol (tủa) và phương pháp Boom.
Các quy trình xử lý mẫu và tách chiết RNA, DNA phù hợp sẽ được rút ra từ các kết quả
trên.
1.2. Quy trình RT-PCR phát hiện PRRSV, PEDV, TGEV, rotavirus và quy trình
PCR phát hiện E. coli, Salmonella spp. và C. perfringens
 RNA tách chiết từ mẫu nhiễm các virus như PRRSV, PEDV, TGEV, rotavirus

18

được phiên mã ngược bằng phương pháp RT (reverse transcription) rồi nhân bản bằng
phương pháp PCR.

19

được so sánh với cơ sở dữ liệu gene (GenBank) để rút ra kết luận về độ đồng nhất của trình
tự nucleotide mà chúng tôi có so với các trình tự đã công bố đặc trưng cho mỗi tác nhân.
 Độ nhạy kỹ thuật của các quy trình được xác định dựa trên các trình tự mục tiêu
tạo dòng hoặc tổng hợp nhân tạo. Độ nhạy được tính toán với các nồng độ pha loãng khác
nhau của các trình tự mục tiêu đối với từng tác nhân gây bệnh khảo sát.
Từ các kết quả thu được, chúng tôi chọn ra các quy trình RT-PCR và PCR multiplex
phù hợp cho các tác nhân cần phát hiện.
1.3. Quy trình real-time RT-PCR phát hiện PRRSV
Phương pháp real-time PCR có ưu điểm lớn so với phương pháp PCR cổ điển do có
độ nhạy cao hơn, thao tác đơn giản hơn và hầu như không có khả năng ngoại nhiễm tuy vẫn
có nhược điểm là chi phí cao hơn và cần thiết bị đắt tiền hơn. Việc xây dựng quy trình RT-
PCR real-time cho PRRSV là nhằm cung cấp một chọn lựa khác nếu hội đủ điều kiện.
Trong nội dung này, chúng tôi chọn phương pháp real-time RT-PCR sử dụng Taqman
probe. Phương pháp này có độ đặc hiệu cao hơn so với sử dụng chất phát huỳnh quang liên
kết với mạch đôi DNA như SYBrGreen. Chúng tôi khảo sát và thiết kế các cặp primer và
Taqman probe tương ứng cho vùng gene ORF6/7 của PRRSV, so sánh các cặp primer này và
chọn tổ hợp primer/probe cho hiệu quả nhân bản tốt nhất và đặc hiệu nhất. Tổ hợp
primer/probe cũng được thiết kế cho gene chứng nội.
1.4. Quy trình tạo dòng một số trình tự gene dùng làm chứng dương cho các kit
Một trong những thành phần quan trọng của kit chẩn đoán là mẫu chứng dương giúp
người sử dụng kiểm tra chất lượng của hóa chất cung cấp cũng như hoạt động của thiết bị.
Chúng tôi tạo dòng các trình tự gene được dùng làm trình tự mục tiêu cho quá trình nhân
bản đối với từng tác nhân từ các mẫu virus và vi khuẩn chứng vào chủng E. coli DH5. Các trình
tự tạo dòng được bảo quản ở dạng plasmid tinh sạch và dạng khuẩn lạc. Khi cần thiết khuẩn lạc
được nuôi cấy tăng sinh và plasmid tái tổ hợp được tách chiết và tinh sạch cho sử dụng.
Từ các quy trình thiết lập ở trên, chúng tôi tiến hành xây dựng các kit

20


21

thuyết và thực tế, chúng tôi sẽ chọn các đối tượng khảo sát phù hợp với tình hình ở Việt Nam.
Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng
1. Tách chiết DNA, RNA theo phương pháp Boom (1990): mẫu được ly giải bởi
guanidine thiocyanate, DNA/RNA được hấp phụ trên các hạt silica. Sau nhiều bước rửa để
loại tạp chất, DNA/RNA được dung giải trong nước hay trong dung dịch TE (Tris-EDTA)
2. Tách chiết DNA, RNA theo phương pháp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (tủa):
mẫu được ly giải với SDS hay một số hóa chất khác, protein trong mẫu được loại bỏ bằng
hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol. Sau đó DNA/RNA được thu hồi qua ly tâm
sau khi tủa với ethanol hay isopropanol.
3. Phương pháp thiết kế các primer và probe: các phần mềm Annhyb, Primer Premier,
ClustalX, Oligos được sử dụng để tìm các vùng bảo tồn trên các vùng gene mục tiêu, thiết kế
rồi kiểm tra các đặc tính của các oligonucleotide đã thiết kế.
4. Phương pháp PCR: DNA sau khi thu hồi được nhân bản trong phản ứng do hoạt động
kéo dài các primer đã bắt cặp đặc hiệu trên mạch khuôn của enzyme Taq polymerase. Sản phẩm
khuếch đại của mỗi vùng gene mục tiêu có độ dài phân biệt với các sản phẩm còn lại.
5. Phương pháp RT-PCR: RNA sau khi thu hồi được chuyển thành cDNA dưới hoạt
động phiên mã ngược của enzyme reverse transcriptase (RT). Phản ứng PCR sau đó sử dụng
cDNA để làm mạch khuôn cho quá trình tổng hợp sản phẩm.
6. Phương pháp điện di trên gel agarose: Các sản phẩm nhân bản của phản ứng PCR
có độ dài khác nhau di chuyển với tốc độ khác nhau trong môi trường bán rắn của gel
agarose dưới tác động của điện trường. Kích thước của các sản phẩm được xác định tương
đối khi so sánh về vị trí với các thang chuẩn.
7. Phương pháp real-time PCR sử dụng Taqman probe: Hoạt động tổng hợp sản phẩm
PCR của Taq polymerase làm phân cắt Taqman probe bắt cặp đặc hiệu bên trong vùng gene mục
tiêu và giải phóng ra một phân tử phát huỳnh quang. Mẫu được kết luận dương tính khi cường độ
huỳnh quang thu được trong phản ứng tăng cao hơn giá trị ngưỡng tại một thời điểm bất kỳ.
8. Phương pháp Southern blot sử dụng probe là DNA đặc trưng cho trình tự mục tiêu

cấp ở heo đã đăng ký
- Áp dụng các quy trình đã xây dựng vào việc tạo 4 loại kit như đã đăng ký; kiểm tra khả
năng sử dụng thực tế của các kit này
- Đào tạo và chuyển giao kỹ thuật cho các thành viên từ TT UDCNSH ĐN
- Chịu trách nhiệm cung cấp các thiết bị và hóa chất cũng như các chi phí khác cần thiết
cho nội dung nghiên cứu; đề tài được thực hiện tại phòng R&D của CT TNHH CNSH KT
Nhân lực: 05

23

2. Chi cục thú y Đồng Nai do Ông Trần Văn Quang – Chi cục phó- đại diện:
-Điều tra, liên kết với các hộ nông dân;
- Thu mẫu thực địa;
- Thu nhận các thông tin liên quan đến tình hình dịch bệnh của đàn heo và mẫu heo thu nhận.

Nhân lực:02
20 Phương án hợp tác quốc tế (nếu có)
(Trình bày rõ phương án phối hợp: tên đối tác nước ngoài; nội dung đã hợp tác- đối với
đối tác đã có hợp tác từ trước; nội dung cần hợp tác trong khuôn khổ đề tài; hình thức
thực hiện. Phân tích rõ lý do cần hợp tác và dự kiến kết quả hợp tác, tác động của hợp
tác đối với kết quả của Đề tài )
Không có
21 Tiến độ thực hiện

Các nội dung, công việc
chủ yếu cần được thực hiện;

các mốc đánh giá chủ yếu
K
ết quả phải đạt
24

tình hình heo bệnh
- 500 mẫu heo bệnh
tiêu chảy cấp
CCTYĐN

Công việc 2: Xây dựng quy
trình xử lý mẫu và tách chiết
RNA virus hay DNA vi khuẩn
bằng hai phương pháp tủa và
Boom.

Chọn được phương
pháp tách chiết RNA
và DNA cho hiệu
quả tách chiết cao

2 tháng CT TNHH
CNSH KT Công việc 3: Xây dựng quy
trình RT-PCR phát hiện
PRRSV, PEDV, TGEV,
rotavirus và quy trình PCR
phát hiện E. coli, Salmonella
spp. và C. perfringens

các phản ứng PCR
multiplex
- Xác định được tính
đặc hiệu các sản
phẩm PCR
- Xác định được độ
nhạy kỹ thuật của
các phản ứng PCR
monoplex và
6 tháng CT TNHH
CNSH KT 25

coli, Salmonella spp. và C.
perfringens với nội dung
tương tự trên.
- So sánh các quy trình PCR
multiplex với PCR monoplex
- Tiến hành Southern blot trên
các sản phẩm PCR
- Giải trình tự các sản phẩm
PCR
- Tính toán độ nhạy kỹ thuật
của các phản ứng PCR
multiplex
- Chọn được quy
trình RT-PCR, PCR
monoplex và

huyền phù tế bào
2 tháng CT TNHH
CNSH KT

2
Nội dung 2: Tạo 4 kit chẩn
đoán và thử nghiệm kit trên
mẫu thực địa Công việc 1: Tạo 4 loại kit
- 4 loại kit, mỗi loại 9 tháng

CT TNHH