1

Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn Chương trình hợp tác nông nghiệp và phát triển nông thôn
(CARD) 013/06VIE
Thay thế phân bón hoá học N bằng chế
phẩm vi sinh cố định đạm cho cây họ đậu
để tăng thu nhập cho nông dân và bảo vệ
môi trường MS6: Báo cáo Chế phẩm Nốt sần Chất lượng cao Tháng 9 năm 2009
Mục lục

1. Thông tin về các viện 2
2. Liên lạc 2

Tháng 3/2009
Thời gian hòan tất (sửa đổi)
11/2009
Giai đoạn
12/2008 – 9/2009

Cán bộ liên lạc
Tại Úc: trưởng nhóm
Tên:
Dr David Herridge
Telephone:
02 67631143
Chức vụ:
Nhà Khoa học cao cấp
Fax:
02 67631222
Cơ quan
Sở các nghành Công nghiệp
cơ bản NSW
Email:


Tại Úc: cán bộ quản lý
Tên:
Mr Graham Denney
Telephone:
02 63913219
Chức vụ:
Quản lý Tài chính
Fax:

3. Những điểm nổi bật
Ảnh hưởng của hai chủng rhizobium của Úc tại Việt nam đối với sản xuất cây
họ đậu và năng suất, phân tích so sánh giữa các chủng địa phương và chủng
của Úc
Phần này của dự án đánh giá các chủng quốc tế quí hiếm tại Việt nam và so sánh chúng với
các chủng địa phương. Các chủng địa phương và nhập có nguồn gốc từ các viện nghiên cứu
Việt nam, từ NifTAL (USA), ALIRU (Australia), DOA (Thailand), Hàn quốc và Achentina.
Mộ
t số các chủng này hiện đang sử dụng sản xuất thương mại chế phẩm như là chủng
CB1809 (đậu tương) và NC92 (đậu phộng) tại Úc. Chúng tôi thực hiện hai bộ thí nghiệm: thí
nghiệm trong chậu và thí nghiệm ngoài đồng ruộng.
Trong các thí nghiệm trong chậu, có 13 nghiệm thức cho đậu phộng (11 chủng, đối chứng có

và thảo luận trong các hội thảo, hội nghị đầu bờ và các ấn bản khuyến nông. Để chắc
chắn tính ổn định của sản xuất và sử dụng, dự án này có sự tham gia của các công ty tư
nhân trong việc marketing và “sản xuất thử” với mục đích là các công ty này sẽ mở rộng
sản xuất và việc cung cấp chế phẩm sẽ tăng dần lên cùng lúc khi công nghệ
và thị trường
phát triển.

4
Tổng số các thí nghiệm đồng ruộng trong 2007–09 là 36 thực hiện tại 10 tỉnh trong nước.
Các thí nghiệm này được thực hiện tại các vùng trồng cây họ đậu chính tại Việt nam, từ vùng
núi cao phía bắc, vùng Duyên hải miền Trung đến vùng đất cao Miền nam và Đồng bằng
Sông Cửu Long. Các tỉnh tham gia thí nghiệm này là Sơn La, Nghệ An, Bình Định, Bình
Thuận, Daklak, DakNong, Tây Ninh, Đồng Tháp, An Giang và Trà Vinh. Có ít nhất 5
nghiệm thức thí nghiệm:

1. Nông dân, không bón phân N
2. Nông dân, bón phân N
3. Nhiễ
m với chủng của Úc CB1809 (đậu tương) hoặc là NC92 (đậu phộng), không bón
phân N
4. Nhiễm với chủng địa phương: SL1 (đậu tương) hoặc GL1 (đậu phộng), không bón
phân N
5. Nhiễm với chủng địa phương: SL2 (đậu tương) hoặc GL2 (đậu phộng), không bón
phân N
Các chủng của Úc có hoạt tính cao nhất theo nghĩa là tăng nốt sần, năng suất sinh khối và
năng suất hạt. So sánh với nghiệm thứ
c không nhiễm, CB1809 và NC92 tăng nốt sần của đậu
tương và đậu phộng trung bình là 58%, sinh khối 30% và năng suất hạt là 29%. So sánh với
các chủng địa phương của Việt nam, các chủng, CB1809 và NC92, tăng nốt sần của đậu
tương và đậu phông trung bình là 22%. Năng suất sinh khối tăng trung bình là 10% và năng

khả năng tăng cường tính hiệu quả này. Các chỉ dẫn chi tiết được nêu ra đối với pH và lượng
nước thích hợp đối với cơ chất dùng cho sản xuất.

Một thí nghiệm đã được hoàn tất so sánh các phương pháp khử trùng than bùn khác nhau.
Sau khi than bùn được khử trùng một số mẫu đượ
c sử dụng trực tiếp để xác định tạp nhiễm.

5
Các mẫu than bùn khác cấy vào môi trường Glucose Pepton lỏng và sau đó dịch lỏng này
được đánh giá mức độ nhiễm vi sinh vật sau 3 giờ, 24, 36 và 72 giờ. Các mẫu này cũng đã
được nhiễm với rhizobium và sau đó xác định số lượng trong mẫu theo thời gian. Nghiệm
thức tốt nhất theo nghĩa là có số lượng rhizobium cao nhất và có số lượng vi sinh vật tạp
nhiễm thấp nhất là nghiệm thức khử trùng bằng autoclave ở 60 phút và chiếu x
ạ gamma liều
lượng 30 kGy.

Hiện tại Việt nam chưa có tiêu chuẩn chất lượng riêng cho chế phẩm vi khuẩn nốt sần mà chỉ
mới có tiêu chuẩn cho phân bón vi khuẩn cố định đạm. Tuy nhiên, rất quan trọng để có
chương trình QA cho chế phẩm vi khuẩn nốt sần (rhizobia). Một số cải thiện đối với Tiêu
Chuẩn Quốc gia Việt nam cho Phân bón Vi sinh vật Cố định đạm (TCVN 6166-1996) đã
được thực hiệ
n để làm cho nó phù hợp hơn đối với chế phẩm vi khuẩn cố định đạm rhizobia,
dựa vào công nghệ sản xuất và đòi hỏi về hiệu quả. Tiêu chuẩn mới này sử dụng cấu trúc tốt
và dễ hiểu của tiêu chuẩn hiện tại. Tên cho tiêu chuẩn được đề xuất là Tiêu chuẩn Quốc Gia
Việt nam đối với Cế phẩm vi khuẩn nốt sần ở cây họ đậ
u. Tiêu chuẩn này bao gồm chi tiết về
các yêu cầu kỹ thuật của chế phẩm, bao gồm cả nhãn hiệu hàng hoá cũng như phương pháp
tiến hành và báo cáo.

Kết quả trình diễn đồng ruộng và hiệu quả của các trình diễn này đối với việc

đạm khí trời bởi rhizobia. 6
5. Báo cáo chi tiết
Báo cáo này bao gồm chi tiết về các thí nghiệm về chủng rhizobia, qui trình sản xuất chế
phẩm, QA, phân phối và ứng dụng chế phẩm, kết quả và đánh giá các trình diễn đồng ruộng ,
theo tiêu đề đòi hỏi của báo cáo, như sau:
• Giới thiệu hai chủng của Úc vào Việt nam, ảnh hưởng của nó đến sản xuất cây họ đậu
và hiệu quả, phân tích so sánh giữa các chủng địa phương và nhập nội.
• Qui trình sản xuất chế phẩm chất lượng cao, đóng gói, dự trữ, phân phối và áp dụng
trên đồng ruộng và quản lý chất lượng trong quá trình sản xuất.
• Kết quả trình diễn đồng ruộng, bao gồm đánh giá sinh học và kinh tế, chỉ ra lợi nhuận
sau này đối với hệ thống canh tác xen canh và hiệu quả của trình diễn đồng ruộng
trong việc cải thiện hiểu biết của nông dân v
ề lợi nhuận mang lại từ chế phẩm.

5.1. Giới thiệu hai chủng của Úc vào Việt nam, ảnh hưởng của nó đến sản xuất
cây họ đậu và hiệu quả, phân tích so sánh giữa các chủng địa phương và
nhập nội

Giới thiệu

Nghiên cứu về chế phẩm cố định đạm cho cây họ đậu đã được thực hiện từ những năm 1980
t
ại Trường Đại học Hà nội, Viện Nông hoá Thổ nhưỡng SFI (VASI), và ở Miền Nam là
Trường Đại học Cần Thơ (CTU), IAS và OPI (nay đổi tên là IOOP). Một cách tổng quát,
mục tiêu nghiên cứu là lựa chọn các chủng, sản xuất nhỏ và thực hiện các thí nghiệm đồng
ruộng đánh giá hiệu quả của chế phẩm. Mỗi viện tập trung nghiên cứu ở các vùng nhất định
và nhóm cây trồng khác nhau, ví dụ như CTU tại Đồ

manitol lỏng (YMB) từ 5 – 7 ngày để đạt được độ đục tối đa (khoảng 1 x 10
9
tế bào/ml).
Dịch sinh khối lỏng này sau đó được trộn vào than bùn đã khử trùng và để cho ổn định trong
1 tuần. Hạt được nhiễm với chế phẩm 10
5
–10
6
tế bào/hạt ngay trước khi gieo.

Thí nghiệm đã sử dụng đất cát bạc màu tại Trảng Bàng, Tây Ninh. Đất được lấy ở độ sâu 10–
15 cm và vận chuyển về Trạm Thực nghiệm Bình Thạnh của OPI. Đất được trộn đều, sau đó
qua rây 5-mm. Đất sau đó trộn đều với bụi xơ dừa (1:1) và vôi và để yên 1 tuần. Mỗi chậu
1.7 kg hỗn hợp này. Khả năng giữ nước củ
a đất được xác định để xác định lượng nước thêm
vào. Phân bón áp dụng như sau: KH
2
PO
4
- 195 mg/pot; KCl - 168.4 mg/pot; MgSO
4
.7H
2
O -
22.21 mg/pot; ZnSO
4
.7H
2
O - 20.63 mg/pot; (NH
4

14 SEMIA 5019 Đậu tương NifTAL
15 S01015 Đậu tương Thailand
16 S1059 Đậu tương Thailand
17 Ach Đậu tương Argentina
18 YCK Đậu tương Korea
19 SL1 Đậu tương SFI – local strain
20 DT2 Đậu tương SFI – local strain
21 SL2 Đậu tương SFI – local strain
22 DL1 Đậu tương OPI – local strain
23 DL2 Đậu tương OPI – local strain
24 CJ1 Đậu tương OPI – local strain
25 CJ2 Đậu t
ương OPI – local strain
26 S6 Đậu tương OPI – local strain
27 S37 Đậu tương OPI – local strain 8
Thí nghiệm đồng ruộng

Thí nghiệm đồng ruộng được tiến hành tại 10 vùng trồng đậu chính tại Việt nam, từ vùng núi
cao phía bắc, vùng Duyên hải miền Trung đến vùng đất cao Miền nam và Đồng bằng Sông
Cửu Long. Các tỉnh tham gia thí nghiệm này là Sơn La, Nghệ An, Bình Định, Bình Thuận,
Daklak, DakNong, Tây Ninh, Đồng Tháp, An Giang và Trà Vinh.

Có ít nhất 5 nghiệm thức thí nghiệm:

1. Nông dân, không bón phân N
2. Nông dân, bón phân N
3. Nhiễm với chủng của Úc CB1809 (đậu tương) hoặ

khi tiến hành thí nghiệm. Phương páho nhiễm vào hạt được áp dụng. Các phương pháp lấy
mẫu, tiến hành xác định nốt sần, sinh khối và năng suất hạt ssẽ được cung cấp nếu cần.

Kết quả và thảo luậ
n

Lựa chọn các chủng

Tất cả các chủng thí nghiệm đều làm tăng nốt sần và năng suất bso với đối chứng (bảng 2).
Dựa vào các số liệu của nốt sần phân ra làm 3 nhóm:
- Nốt sần cao nhất: NC92, GL1, GL2
- Nốt sần trung bình: P12, GL14, P03818
- Nốt sần thấp: P08183, CTP, P31, LAC1, Tal179

9
Có tương quan chặt giữa số lượng nốt sần, trọng lượng nốt sần và sinh khối (r
2
=0.82) trong
khi đó tương quan giữa nốt sần và chiều cao cây không đáng kể (r
2
=0.27). kết quả cho thấy at
NC92, GL1 và GL2 là các chủng tốt nhất. Chúng sản xuất nhiều nốt sần và nhiều sinh khối
hơn các chủng khác.

Bảng 2. Nốt sần và tăng trưởng của lạc nhiễm với các chủng rhizobia khác nhau

Chủng rhizobium
Số lượng nốt
sần/cây
Trọng lượng nốt

sần/cây (mg)
Chiều cao cây (cm)
Sinh khối khô
(g/cây)
12. U110 47 cd 129 d 38 defg 2.8 d
13. DT2 45 de 121 e 35 defg 2.7 e
14. CB1809 52 bc 149 b 43 abcd 3.3 bc
15. CJ1 35 fg 121 e 41 bcde 2.7 e
16. DL2 30 g 72 h 34 efg 1.6 hi
17. S37 16 h 103 f 50 a 2.3 f
18. SL2 66 a 170 a 42 abcd 3.7 ab
19. CJ2 49 cd 136 cd 42 abcde 2.9 c
20. DL2 35 fg 114 e 37 defg 2.5 e
21. SL1 57 b 141 c 37 defg 3.1 cd
22. YCK 33 fg 77 gh 48 ab 1.7 gh
23. S01015 35 fg 121 e 46 abc 2.6 e
24. SEM 5019 34 fg 118 e 39 cdef 2.6 e
25. DL1 39 ef 83 g 39 cdef 1.8 g
26. S6 21 h 80 g 39 cde 1.7 gh

10
27. ACH 22 h 69 h 30 g 1.5 i
28. S1059 32 fg 97 f 31 fg 2.2 f
Control 1 9 i 35 i 43 abcd 1.3 j
Control 2 8 i 29 i 37 defg 1.4 i
CV% 13.2 5.1 14.6 4.1
Đối chứng 1: không nhiễm, không bón phân N
Đối chứng 2: không nhiễm, bón phân N (100ppm)
Nguồn: OPI


0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Field site
% Respons
eCó ảnh hưởng lớn của nhiễm rhizobium đối với nốt sần ở 72% số ruộng thí nghiệm 9Biểu đồ
1). ở những điểm này, nốt sần tăng 43–166%. Nốt sần tăng trung bình ở 11% trường hợp và
17% trường hợp tăng thấp. Trung bình nốt sần tăng 58% khi sử dụng các chủng của Úc .

12
Graph 2. Range of crop biomass responses to inoculation
0
10
20
30
40
50
60
70

Có sự trả lời khác nhau đối với việc nhiễm với các chủng khác nhau về nốt sần, sinh khối và
năng suất hạt. Các chủng thương mại của úc CB1809 (đậu tương) và NC92 ( lạc) có hiệu quả
cao hơn so với các chủng địa phương Việt nam ở hầu hết các điểm thí nghiệm (Phụ lục 2).
Phân tích số liệu cho thấy khi cây được nhiễm với CB1809 hoặc NC92, trọng lượ
ng nốt sần,
sinh khối, năng suất hạt tăng so với các chủng bản địa, 91%, 94 và 97% các điểm thí nghiệm.
Tuy nhiên, mức độ tăng thì khác nhau phụ thuộc vào điểm thí nghiệm và các chủng bản địa.
Biểu đồ 4, 5 và 6 cho thấy sự tăng về nốt sần, sinh khối và năng suất hạt của đậu tương và lạc
khi nhiễm với CB1809 and NC92, theo thứ tự, so với nhiễm bằng các ch
ủng bản địa.

Hia chủng của Úc, CB1809 và NC92, Tăng nốt sần của đậu tương và lạc trung bình là 22%,.
Sinh khối tăng trung bình 10% (Biểu đồ 5) và năng suất hạt tăng 13% (Biểu đồ 6), so với cá
chủng bản địa.

Đối với mỗi chỉ tiêu, có sự khác biệt lớn tuỳ theo điểm thí nghiệm. Đối với nốt sần, sự khàc
biệt này là 0–70%. Đối với sinh khối là 0–30% và đối vớ
i năng suất là 0–51%. Năng suất
tăng hơn 20% so với các chủng bản địa ở 18% điểm thí nghiệm, từ 10–20% ở 34% điểm và
1–10% ở 48% diểm thí nghiệm. 14
Graph 4. Nodulation increases with CB1809 and NC92 compared to
local strains
0
10
20
30
40

local strains
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Field trials
% Increase
Local strain1
Local strain25.2. Qui trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn nốt sần chất lượng cao, đóng gói,
bảo quản, phân phối và áp dụng trên đồng ruộng và quản lý chất lượng trong
quá trình sản xuất
Trong suốt 2 năm của dự án, công nghệ sản xuất chế phẩm nốt sần ở ba viện nghiên cứu, OPI
and IAS) đã được phát triển. Mục tiêu chính của sản xuất là chế phẩm vi khuẩn nốt sần chấ
t
lượng cao, >5 x 10
8
rhizobia/g và tạp nhiễm cao nhất là 1 x 10
8
vi khuẩn tạp nhiễm/g. Chúng
tôi trình bày sau đây công nghệ hiện tại cho sản xuất chế phẩm tại Việt nam. Một số chi tiết
của qui trình công nghệ khác nhau ở mỗi viện phụ thuộc vào cơ sở vật chất và kinh nghiệm.
Ở một mức độ nào đó thì công nghệ sản xuất chế phẩm được ứng dụng và có thay đổi cho
phù hợp từ các công nghệ của các nước mà công nghiệp sả

o
C) cho tới
khi sử dụng. Cần cấy chuyền các giống này sau mỗi 6 tháng. Số lượng các giống con này thì
phụ thuộc vào đòi hỏi của sản xuất. Nhiệt độ cho sinh trưởng của rhizobium là 30
o
C trong tủ
ấm. Phương pháp khác cũng có thể được áp dụng khi có đòi hỏi cao của sản xuất. Chuyển
sinh khối từ ống nghiệm giống mẹ vào erlen có môi trường YM lỏng, ủ ở 30
o
C trong vòng 5 -
7 ngày. Lấy 2ml của dịch sinh khối này cho vào 2 ml 50% glycerol, đã được khử trùng trước
trong lọ nhỏ. Các ống giống con này được bảo quản trong các tủ lạnh sâu cho sử dụng trước
khi kiểm tra nhiễm trên môi trường CRYMA và YMA.

Sự tăng trưởng của sinh khối

Giống khởi đầu: Cấy ria các chủng sử dụng trên CRYMA và YMA để kiểm tra nhiễm.
nuôi cấy ở 30°C trong 6–8 ngày. Nếu thấy không nhiễm thì cho vào ống nghiệm giống
đó 10
ml nước vô trùng. Đóng nắp lại và lắc nhẹ. Đổ dịch sinh khối này một cách vô trùng vào một
erlen có chứa môi trường nuôi cấy YM lỏng. Đóng erlen với nút bông và giấy. Nhẹ nhàng
trộn đều dung dịch và đặt vào trong máy lắc nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C cho tới khi xuất hiện
dịch có màu sữa (5-7 ngày), và quần thề rhizobium đạt được là 10
9
/ml trong dịch sinh khối.
Dịch sinh khối này sẵng sàng để cấy vào nồi lên men.

Môi trường nhân sinh khối:
Bảng 5. Số lượng tế bào/ml dịch sinh khối trong các môi trường cải tiến so sánh với
môi trường cơ bản YMB

9
5,6 x 10
9

GL1 5,6 x 10
9
2,8 x 10
9
1,9 x 10
9

GL2 5,6 x 10
9
7,2 x 10
9
5,2 x 10
9SX1(g/l): nước chiết đậu xanh 50 g; K
2
HPO
4
0.5 g; KH
2
PO
4
0.5 g; (NH
4
)2SO

Môi trường cho rhizobium sinh trưởng bao gồm nguồn C, nitơ và khoáng chất. Hầu hết
rhizobium sử dụng được pentoses, hexoses, disacharides, polysaccharides and sugar alcohols
mặc dù nguồn C thích hợp cho các chủng rhizobium thì thay đổi. Nói chung là cải tiến môi
trường nhân sinh khối cho rhizobium thì dựa trên căn bản môi trường YMB (yeast mannitol
broth).

Sản xuất lớn thì đòi hỏi môi trường rẻ tiền và sẵn có ví dụ như là dịch bắp và dịch thuỷ phân
vỏ đậu. Bảng 5 trình bày ảnh hưởng của môi trườ
ng nhân sinh khối đến sự tăng trưởng của 6
chủng rhizobia. Các thử nghiệm là nước chiết đậu xanh, saccharose và glucose thay vì yeast
extract và mannitol mắc tiền. Số lượng tế bào rhizobia của 6 chủng cao hơn 10
9
/ml trong 2
môi trường đề nghị là SX1 và SX2, tương tự như môi trường YMB. Môi trường SX1 là môi
trường tốt nhất theo nghĩa là hiệu quả và kinh tế.

Số liệu rất hứa hẹn nhưng cần lập lại. Nếu rhizobia tăng trưởng tốt trong môi trường SX1 và
SX2 vẫn tốt, thì chúng có thể xem xét như là môi trường sản xuất chế phẩm nốt sần tại Việt
nam.

Thời gian sinh trưởng : Kết qu
ả cho thấy số lượng của tế bào rhizobium tăng theo thời
gian và đạt cực đại ở ngày thứ 7 đối với tất cả cá chủng. (Bảng 6). Số lượng cao, 7 x 10
9
tế
bào/ml.

Bảng 6. Số lượng tế bào rhizobia trong dịch sinh khối ở các thời gian nuôi cấy khác nhau

Số tế bào/ml

9
4,02 x 10
8
2,4 x 10
8
8,0 x 10
8
2,2 x 10
8
8,4 x 10
8

6 3,2 x 10
9
2,8 x 10
9
1,08 x 10
9
3,6 x 10
9
1,24 x 10
9
1,08 x 10
9

7 7,2 x 10
9
4,8 x 10
9
4,8 x 10

- - - - - -
5
- - - - - -
5.5
+ ++ ++ ++ ++ ++
6
++ ++ ++ ++ ++ ++
6.5
+++ +++ +++ +++ +++ +++
7
+++ +++ +++ +++ +++ +++
7.5
++ ++ ++ ++ ++ ++
8
- - - - - -
8.5 - - - - - - 18
-: không phát triển
+: phát triển yếu (10
4
–10
5
CFU/ml)
++: phát triển bình thường (10
6
–10
7
CFU/ml)

–10
9
CFU/ml
Nguồn: SFI

Kết quả từ bảng 7 và 8 cho thấy pH môi trường và nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh trưởng
của rhizobiuam. Tất cả 6 chủng thử nghiệm đều phát triển tốt ở pH 6.5–7 và 30
0
C.

Quá trình nhân sinh khối: Phụ thuộc vào đầu tư trang thiết bị, thiết bị sẵn có và kinh
nghiệm nhà sản xuất sẽ cần xem xét dung tích của nồi lên men. Các mẻ sản xuất lớn thì tiết
kiệm thời gian nhưng rất dễ bị tạp nhiễm. Nồi lên men có thể thay đổi kích thước từ 1–2 L
(bình thuỷ tinh trên các máy lắc hoặc là sục khí) tới >1600 L.

Sinh khối lỏng có thể được sản xuất m
ột cách đơn giản trong các bình thuỷ tinh, như là bộ
lên men bằng bình thuỷ tinh 4-L với đầu ra lấy mẫu gắn vào phần đáy bình. Hệ thống này
nuôi cấy tối đa 2–3 L môi trường. Để mà tránh tạp nhiễm thì không khí được lôc qua bộ phận
lọc nhồi với bông gòn cotton. Tất cả các dây cao su và đầu mối đều được khử trùng. Nút
bằng cao su giữ không khí vào và ra qua lọc được gắn chặt với cổ bình thuỷ tinh. Sử dụng
máy b
ơm nuôi cá nhỏ để cung cấp khí. Nó được gắn với ống không khí ra. Không khí sẽ di
chuyển tự do trong cả hai lọc khí và thổi vào bình lên men. Bông gòn trong bộ lọc khí cần
phải nén vừa phải. Nếu nén chắt quá sẽ hạn chế không khí đi vào.

Thiết bị bơm cần được tháo rời ra khỏi bộ lên men khi khử trùng. Khử trùng trong vòng 40
phút ở 1 atm nếu môi trường là 2 lít và tăng dần lên 10 phút cho mỗi lít môi trường thêm vào.
Sau khi môi trường lên men nguội thì bỏ kẹp ở
ống khí vào và nối nguồn cung cấp khí vào,

- Dễ dàng sản xuất
- D
ễ dàng khử trùng bởi autoclave hoặc là chiếu xạ gramma
- Sẵn có với số lượng đủ
- Không mắc tiền
- Bám dính tốt vào hạt
- Khả năng đệm pH tốt

Than bùn được nghiên cứu nhiều nhất và được sử dụng nhiều nhất như là chất mang cho sản
xuất chế phẩm vi khuẩn nốt sần. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng rhizobia thì được b
ảo vệ và
tồn tại tốt trên than bùn. Bảng 9 và 10 chỉ ra các tính chất lý hoá học của các nguồn than bùn
đã được nghiên cứu kỹ. Đó là các than bùn được dùng cho sản xuất thương mại tại Mỹ và
Úc. Tuy nhiên, tính chất lý hoá học của than bùn không phải là chỉ tiêu duy nhất để xác định
chúng có phù hợp cho sản xuất hay không. Chỉ có thử nghiệm liên quan đến tăng trưởng của
rhizobia mới xác định được chúng có được chấp nhận hay không cho sản xuấ
t. Ngoài các
tính chất của than bùn như là độ măn, sét, lượng hữu cơ và sự tạp nhiễm bới các kim loại thì
còn có các yếu tố không xác định được ảnh hưởng đến sự phù hợp của than bùn như là một
chất mang. Than bùn từ các nguồn khác nhau cần thiết phải kiểm tra sau khi đưa về cùng
kích thước hạt và ẩm độ (nếu có thể). Không thể đánh giá than bùn thông qua màu sắc hay là
cấu trúc của nó.

Bảng 9. Đặc trưng của than bùn dùng cho sản xuất chế phẩm vi khuẩn nốt sần tại Mỹ

Loại Lượng Phân tích tro (%)
N tổng (%) 1.62 K 1.12
Chất hữu cơ (%) 86.80 P 0.33
Tro (%) 13.20 Ca 5.21
K trao đổi (ppm) 62.00 Mg 1.14

Việt nam có rất nhiều mỏ than bùn, phân bố khắp nước nhưng chất lượng thì khác nhau rất
nhiều, từ nghèo (Cần Giờ) cho đến trung bình (Bình Phú) và tốt (U Minh) (Bảng 11).
Bảng 11. Đặc trưng của 3 nguồn than bùn Việt nam

Đặc trưng Cần Giờ Bình Phú U Minh
Tro (%) 50 - 70 40 - 60 7 – 9
OM (%) 14 - 21 25 - 40 46 – 51
Acid humic (%) 5 - 8 14 – 18 30
S (%) 1 - 8 0.3 – 1.5 0.25
Nguồn: Than bùn tại Việt nam và sử dụng trong nông ngjiệp (Nhà Xuất bản Nông nghiệp, 1997)

Bảng 12. Số lượng rhizobia trong các nguồn than bùn khác nhau ở Miền nam

Nghiệm thức Ban đầu 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần
1. Australia 59 x 10
7
30 x 10
8
16 x 10
8
20 x 10
8
17 x 10
8
2. Komix 1 40 x 10
7
22 x 10
8
29 x 10
8

18 x 10
8
22 x 10
8
Treament 2 tháng 3 tháng 4 tháng 5 tháng 6 tháng
1. Australia 31 x 10
8
20 x 10
8
14 x 10
8
12 x 10
8
10 x 10
8
2. Komix 1 28 x 10
8
24 x 10
8
15 x 10
8
17 x 10
8
12 x 10
8
3. Komix 2 25 x 10
7
32 x 10
7
10 x 10

Ngoại trừ Komix 2, 3 nguồn than bùn của Việt nam trong thí nghiệm này tốt cho tăng trưởng
của rhizobia. Số lượng của rhizobia trong các than bùn này đạt ≥ 10
9
cfu/g than bùn ấm,
tương đương với than bùn Úc dùng cho sản xuất thương mại. Số lượng rhizobia trong komix
2 chỉ đạt 3.4 x 10
7
cfu/g than bùn ẩm sau 6 tháng.

Tương tự, nguồn than bùn ở Sơn La và Thái nguyên cũng giúp rhizobia tăng trưởng và tồn tại
tốt, đó là các chủng CB1809, NC92, GL2, SL2. Số lượng rhizobia đạt ≥ 10
9
cfu/g than ùn
ẩm
Bảng 13. Số lượng rhizobia trong hai nguồn than bùn ở Miền Bắc

Number of rhizobia/g moist peat inocualnts
Rhizobium
strain
Nguồn than
bùn
Ban đầu 1 tuần 2 tuần 1 tháng 2 tháng 3 tháng
Sơn La 3,2 x 10
9
1,8 x 10
9
4,2 x 10
9
7,2 x 10
9

Thái Nguyên 1,2 x 10
9
2,4 x 10
9
1,2 x 10
9
1,1x 10
9
3,6 x 10
9
1,2 x 10
9
Sơn La 6,5 x 10
9
1,8 x 10
9
7,5 x 10
9
3,4x 10
9
3,2 x 10
9
3,6 x 10
9
CB1809
Thái Nguyên 5,3 x 10
9
2,8 x 10
9
5,3 x 10

1,2 x 10
9

Nguồn: ISF

Bảng 14. Số lượng của tế bào rhizobia trong các chất mang khác nhau sau 1 tháng

STT Chủng rhizobium Chất mang
Số lượng tế bào
rhizobium (CFU/g)
1 NC 92 Peat 2.7 x 10
7

2 CB 1809 Peat 5.4 x 10
6

3 NC 92 Peat + worm casts 8.3 x 10
8

4 CB 1809 Peat + worm casts 5.4 x 10
8

5 NC 92 Peat + worm casts + coconut coir dust 2.5 x 10
9

6 CB 1809 Peat + worm casts + coconut coir dust 6.8 x 10
8

Nguồn : IAS
1 NC92 Peat

pH chất mang: pH chất mang quan trọng và tính acid của than bùn cần được trung hoà với
calcium hay là magnesium carbonate. pH thích hợp là 6.5–7.0. Vôi mịn dùng trong nông
nghiệp thì thích hợp cho việc trung hoà than bùn.

Chỉnh pH của than bùn cần phải thực hiện tật cẩn thận, chờ thời gian cân bằng. Phả ứng giữa
vôi và H
+
trong than bùn phụ thuộc kích thước của cả vôi và than bùn. Hạt càng nhỏ thì phản
ứng càng nhanh. Ẩm độ của than bùn cũng quan trọng. Số lượng vôi để trung hoà cũng phụ
thuộc vào lượng chất hữu cơ, sét và khả năng đệm của than bùn. Sau khi trộn lẫn than bùn và
vôi thì cần thiết cho phép phản ứng xảy ra trong vài tuần trước khi đo pH. Cũng cần thiết đo
pH theo thời gian. Vôi mịn dùng trong nông nghiệp (Aglime, calcium carbonate qua rây 150
µm mesh) là vôi tốt nhất sử
dụng để trung hoà than bùn. Vôi xây dựng thì quá mạnh còn các
vôi khác thì lại nhẹ.

Tính toán lượng vôi như sau:
- Cho 10 g chất mang vào trong 90 ml nước chứa trong erlen 400 ml
- Quậy đều bằng khuấy từ trong khi đo pH bằng pH meter và cho thêm từ từ vôi vào
cho đến khi đạt pH of 6.5
- Ghi nhận số lượng vôi trung hoà với 10 g cơ chất
- Cho lượng vôi đã xác định vào trong lượng xác định của cơ chất. Trộn kỹ.

Khả năng giữ n
ước: Khả năng giữ nước của chất mang xác định số lượng dịch sinh khối
cần cho vào cơ chất. Cơ chất thì rất thay đổi trong khả năng giữ nước của nó. Kích thước hạt,
lượng hữu cơ, sét của than bùn ảnh hưởng đến khả năng giữ nước. Tăng khả năng giữ nước
là điều mng muốn để có số lượng lớ
n hơn dịch sinh khối đưa vào than bùn trước khi ủ.


mang. Mức ẩm độ này thường
được chỉ trong % dựa trên trọng lượng ẩm.

Bảng 15. pH và số lượng dịch sinh khối thêm vào trong than bùn ẩm
*Than bùn pH Lượngdịch sinh khối
Australia 7 65
IAS 6.5 24
Nghe An 5 50
U Minh 6 60
DakNong 6 38
Komix 1 5 35
Komix 2 5 25

Nguồn: OPI
Than bùn Úc và IAS đã được chỉnh pH với vôi
Than bùn ẩm
*
: 20% ẩm độ

Lượng dịch sinh khối thêm vào than bùn thay đổi phụ thuộc vào nguồn than bùn (Bảng 15).
Than bùn U Minh rất giống với than bùn thương mại của Úc với chất lượng chế phẩm cao.

Ẩm độ 40 đến 50% thì thuận lợi nhất cho sự tăng trưởng và tồn tại của nhiều chủng rhizobia.
Cải thiện ẩm độ than bùn hoặc là hỗn hợp của than bùn và các chất mang khác thì cần chú ý
(Bảng 16). Trước khi trộn than bùn với dị
ch sinh khối, than bùn cần được khử trùng ở ẩm độ
20%. Hiệu quả khử trùng cần được xác định bằng cách tiêm dịch môi trường vào than bùn và

Ví dụ: Bao nhiêu dịch nghĩa là sinh khối lỏng được thêm vào 150g than bùn với 20% ẩm độ
để có được ẩm độ là 35%?
a)
Khối lượng của than bùn khô

20
100
x 150 g = 30 g

150 g – 30 g = 120 g

b)
Ẩm độ thêm vào cho than bùn khô

35
120 100
x
x
=
+0.35(120 )
x
x
=
+

42 0.35
x


Đếm số lượng rhizobium và xác định rhizobium trong các chế phẩm than bùn như sau: pha
loãng chế phẩm trong nước vô trùng (10g chế phẩm trong 90 ml nước), sau đó chuẩn bị các
dịch pha loãng cho đến 10
-6
. Cấy trải trên đĩa petri có môi trường CRYMA và đếm số khuẩn